動物體細胞幹細胞化的新途徑

作者/蘇仲卿(臺灣大學生化科技學系名譽教授)

今年1月30日(農曆除夕),在日本NHK晚上7點新聞報導看到,設於神戶的理化學研究所,一位年輕(30歲)女性研究員小保方晴子(Obokata Haruko)領導的幹細胞研究團隊,發展了以「壓力」或「傷害」為刺激的方式,由新生小鼠的體細胞產生全能幹細胞,而將其現象稱為「刺激引發多功能的獲得」(Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency, STAP)。

2012年,日人山中伸彌教授以iPS細胞(induced Pluripotent Stem Cell)之造出,獲得諾貝爾獎而轟動一時不久,就有年輕女性科學家以簡單技術,於短時間內以高產量產出比iPS細胞更安全的「全能細胞」。該新聞被發表之後,不過一週之內,筆者開始撰寫本文時,已經有不少社會與學術界的反應呈現。以下就筆者所讀資料,提出論文的介紹及我感與我思。


日本鼓勵女性進入理工系行業的社會要求

日本目前的理工系行業的就業與就學人口中,女性所佔比率,研究部門12%,大學教師15%,大學生20%,在先進國家中比例最低。為因應人口老化與少子化的現況,鼓勵女性就業,特別是由男性主導的理工部門,成為政府與社會的強烈推動的領域。2010年開始,日本媒體開始流行Rikejo(リケジョ)一詞,是「理系女子」的略語,所指為理工系女大學生、女性研究者、以理工系大學學系為志願的女高中生、理工系公司女職員等。株式會社講談社(一家大出版社,《讀賣新聞》的東家)設有稱為RIKEJO的網站(是講談社的登錄商標),其活動以支持女性的理工系就學與就業為目的。STAP細胞的發現由年輕女性主導,因而日本媒體相關報導語言中,多出現「リケジョ」一詞,並且論及理化學研究所已給予這位獲得博士學位只有三年的女性科學家,充分發揮能力的環境和高度的肯定。

媒體採訪報導的不當

網站的資料中,有小保方晴子使用幻燈片介紹其成就的短暫影片,可看出她工作時不穿傳統男女不分的白色實驗衣,而是日本女性在廚房穿的白色「割烹着」(衣着之類,日文用着字),說是祖母給他做的,又實驗室中的一些用具,有粉紅彩色與小可愛圖樣等,顯示她的年輕與女性本色。但是,新聞發表的第二天,小保方在她的網站貼出告示,表示媒體的許多動作與報導內容,妨害她與親朋的隱私與自由,對於剛站在出發點的研究工作與其將來發展,會產生很大的障礙,請媒體體諒放手,而次日理化研究所也貼出「不再接受採訪」的告示。讓筆者想起,在日本特為女性科學家產生固有名詞リケジョ,其實是一種對女性的偏見,亦見於日本媒體的事實。

見於媒體的非科學報導,到此為止,以下報告科學部分。

發現的動機

小保方生於1983年,在早稻田大學理工學部應用化學科,以主修微生物學取得學士學位(2006年3月)後,轉入再生醫療部門,2011年3月完成早稻田大學大學院先進理工學研究科生命醫科學博士課程。研究生五年期間,有二年留學於美國哈佛大學醫學院Charles A. Vacanti教授的研究室,而其間(2008年)得到可能造出STAP細胞的端序。

在動物成體內是否有幹細胞,是有相當多爭議的問題,而小保方進修就教的Vacanti教授,認為體內可能有非常少數、體積比分化的體細胞小的幹細胞。小保方使用內徑不同的毛細管,進行分離不同大小細胞的過程中發現,一再通過毛細管的細胞,小型者數目比率增加的事實。因而想到是否分離過程中細胞,通過毛吸管時受到傷害或刺激,就是分化完成的體細胞,被還原為幹細胞的原因。

構想獲得證明的過程

小保方發表於Nature第505卷(2014年1月30日)的兩篇(641~647頁及676~680頁)報告,經過9個月審核時間才被接受,而於2010年提出於Nature的論文則不被接受(說有相當不客氣評語),可見經過相當大的折磨。

雖然分化完成的植物細胞,經過癒合組織培養(callus tissue culture)的過程,在適當的培養條件下,可以發揮其全能性(totipotency)而成育為完整植物個體,早被植物生物技術普遍應用。但是,小保方想將在植物上產生幹細胞的作法(她的新聞發表會影片,顯示與植物的比對),應用在高等動物如哺乳類在當時被認為不可能實現,這是學術界依據多年經驗的普遍性智慧(common wisdom),更何況當時已有以基因轉殖方法育成iPS細胞的技術被確立。所以,她在哈佛找不到合作對象,以證明他所養成的細胞是具有全能性的幹細胞,可以說是理所當然。

她的轉機來自日本東北大地震的社會動盪;因不得延續在美國的工作簽證而不能繼續在哈佛研究,於是求職於理化學研究所,而得到時任該所一個研究單位領頭(現在已轉任山梨大學教授)的若山照彥(Teruhiko Wakayama)研究員(Nature第一篇論文的第二作者,也是第二篇的合作者)的合作。報刊的報導說,開頭若山研究員也認為是不可能的任務,但是他也喜歡挑戰而接受邀請。開始時小保方使用已成熟的小鼠而獲得不能滿足的結果;依據若山的建議改用新生小鼠,才獲得明確的成果。

論文內容

為達成目摽,研究材料的選擇非常重要,因為與研究成果的確定性與可使用研究技術密切相關。她使用的細胞是由生後一週小鼠脾臟分離得到、具有螢光蛋白質Oct4-gft轉殖基因(只在全能細胞中表現)的CD-45+血球(亦即完全分化的淋巴球)。因其有明確的分子標籤CD-45+可用其抗體標幟辨別,Oct4-gft可直接觀察其螢光以辨別全能化細胞,又轉變後細胞體積較小等,都可為使用各類顯微鏡技術分析細胞學相關變化,亦可利用細胞選篩器(cell sorter)取得分離與定量等資料,因為有綿密而完整實驗設計由完整的研究團體執行,才有可能打破常識的結論被一流學刊接受,也就是跨過獲得公認的門檻。

以下扼要介紹研究結果:

經過多種刺激處理方法的試驗後,論文報導的細胞得自細胞懸浮液的微酸性處理:用鹽酸滴定到pH 5.7,在37℃下維持30分(包括5分鐘離心分離)。

處理後細胞開始縮小,處理過的細胞繼續在正常條件下培養,以連續攝影觀察,二天後有縮小的細胞開始呈現Oct4-gft的表現,可下載電影片欣賞。酸性處理會導致30~50%的細胞死亡,但是存活者有30%機率轉變為Oct4-gft陽性細胞。處理七天後的STAP細胞已失去T淋巴球特有的一些基因表現能力,也呈現Oct4-gft以外的一些「控制多功能相關基因」的表現。但是,為證明所得細胞的全能性,必要採用個體層次的研究辦法才能獲得肯定。

第一篇論文中進而報導,採用注入STAP細胞於正常小鼠的胚泡(blastocyst)產生複合個體(chimera),得到胚胎體全部呈現非常明顯Oct4-gft所表現的螢光,以及該轉殖基因可傳給後代等結果,得以證明,完全分化的體細胞,可以外加的刺激,發動脫離分化的機制而完成其「脫分化」生物過程,成為具有與胚幹細胞(embryonic stem cell,ES細胞)一樣的全功能性。

在他們所用的細胞培養液中,STAP細胞不能獲得與ES細胞同樣的高增殖率。第二篇論文報導,將建立ES細胞株慣用的增殖因子(ACTH、LIF)添加於培養液時,STAP細胞增殖率可達到ES細胞的程度,並且,使用在修飾過的培養液育成的細胞造成的複合個體,顯示STAP細胞亦可產生胎盤組織,是使用iPS及ES細胞都未能呈現的功能。

胎盤組織源自ES細胞以外的另一種幹細胞(滋養層幹細胞,Trophoblast stem cells,TS細胞)。所以,可以合理推想,STAP細胞兼有ES與TS兩種幹細胞的功能,換言之,STAP細胞的去分化度高於ES與TS的「更原始」幹細胞。

刊載這兩篇論文那一冊Nature的News In Focus部分,有一頁扼要介紹這兩篇論文的短文。其中介紹,小保方已經由十多種組織細胞造出STAP細胞;目前她想努力突破的是造出成鼠及人類的STAP細胞,並解明STAP現象的機制。

這一短文也介紹若山照彥的一個「夢」。由於ES細胞不能為胎盤的來源,胎生動物的「複製」(cloning)都必要先取得未受精卵,進行體外操作才能移入代理孕母。也許STAP細胞可能直接移入代孕母而生出複製體。

幾點我思

1. 身為植物生化學家,並且為「地球上所有生命體共有一個祖先,不同生物以其分化點互相聯繫構成複雜網路,不管其經過的轉折點多少,現有生物種都經過相同長度的進化時間」學理,及「所有生命體構成『地球生命一家』生態系」的理念的信仰者,小保方的論文給筆者一種很意外的滿足感,因為,小保方的堅持所挖出來的「生命的一致性」加強筆者的所信,則「生命的大原則有整合統一性,但是會有依據生活大環境與體內小環境不同的細節有差異性」。細胞的分化機制不是多細胞生物都必要遵守的大原則?

2. 筆者相信,本發現的起點可以說是小保方的觀察注意力細膩、好奇心強、不盲目相信權威、堅持信念等人格特性。她的實驗室布置非常女性化,又出現於記者會時打扮得漂亮,但是,一旦發現媒體的過度宣揚有可能對她的研究發生壞影響時,立刻採取防範措施,是值得欽佩的個性,可為年輕學者的典範。

3. 理化學研究所以財團法人方式成立於1916年,中途經過幾次改組,現在是由文部科學省管轄的獨立行政法人;其學術名聲很高,管轄日本國家重量級研究措施,設有不少研究所,歷代所長都是日本學術界的頂尖人物。現在有完成博士學位三年的年輕女性「研究班長」(group leader)出自該所,躍出國際學術界前端的成績,可見其已有很先進的學術研究環境,筆者深感「羅馬不能一日建成」。

4. 一人能力有限。雖然個人思考範圍可以無遠不及,實驗科學研究的個人可執行範圍非常有限。小保方如不在理化學研究所得到組合研究團體的機會,相信她的夢想成真的機會,不會來得如此快(雖然她說苦惱了五年)。現今科技研究的很多課題,其範圍、層次、整合性、複雜性都必要以團體合作才能規劃執行。但是,筆者覺得我國學術界人士抱持「唯我獨尊」的觀念者太多,因而組成研究團體的機會不多。如何改革?

5. 閱讀小保方的論文時,碰到論文上的一個筆誤而產生了對「學習」與「教育」相關問題的感慨。Pasteur pipette(滴管)是一種生物與化學實驗用的小工具,前一字是活躍於19世紀的法國偉大微生物學家的大名路易巴斯德(Louis Pasteur)的姓部分,現在還有巴斯德研究所(Pasteur Institute)的存在,可見大概是巴斯德的學生為紀念他而命名的。但是,小保方的論文中,有幾處出現pasture pipette。pasture是英文中的普通名詞,Pasteur是個專有名詞,拼法也不同,為何有此筆誤,令筆者迷惑。

筆者當學生的年代,理化與生物課都是將學理及學科的發展歷史一起學習的,因此,知道Ohm、Faraday、Kelvin、Joule、Celsius等物性量測單位都是相關學者大名的轉用。就學習微生物學的個人經驗而言,大學時代教微生物學的日人老師,以パスツールピペット(巴斯德滴管)的名稱交代所使用的小工具。因為日人稱呼該大前輩的日文發音就是パスツール(巴斯德),所以不要多做說明,就會將歷史人物與該工具的名稱連在一起記憶。類似的有Koch sterilizer(當年在實驗室說Koch就知道是高度一公尺多、有保溫套的圓筒狀蒸釜),是學習與巴斯德同年代的微生物學前驅、德國人羅伯科霍(Robert Koch)所建立純粹培養法技術時瞭解的。是否因為時代進步,必要學習的知識大量增加,課本內容份量越來越多,所以歷史性內容被忽略?

另外一個疑問是,為何有那麼多合作者(包括哈佛教授、副教授)聯名發表的論文會有此明顯的筆誤?論文上表明「撰寫者」是小保方與理化學研究所的另一位研究班長笹井(Sasai),但是,其他人不必閱讀表達意見,特別是資深的聯名者?資深者聯名發表的「文化背景」,好像在臺灣也有人提出見於報端的質疑。筆者覺得,如同意聯名,起碼要負核稿責任。

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